Mycoplasma hyorhinis

Mycoplasma é um gênero de bacilos gram-negativos pertencentes à classe Mollicutes. Mollicutes incluem Mycoplasma e Acholeplasma. Os Mollicutes não possuem parede celular e são de tamanho muito pequeno (200-300 nm), com um pequeno genoma. Uma vez que os Mollicutes não podem produzir muitas das enzimas necessárias para sobreviver, são parasitas obrigatórios das células eucarióticas.

O Mycoplasma hyorhinis tem sido associado principalmente a porcos de criação e, raramente, à pele humana (nos casos em que tem sido associado a esclerodermia). Está associado a doenças emsuínos, incluindo a pneumonia e a síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (PRRS).

Devido à sua ocorrência ampla na natureza, é definido como um contaminante comum de todos os tipos de meios de cultura celular. Os cinco principais contaminantes de cultura de células (95%) foram identificados como sendo: Mycoplasma orale, Mycoplasma arginini, Mycoplasma hyorinis, Mycoplasma fermentans, Acholeplasma laidlawii ou Mycoplasma hominis ¹.

O pequeno tamanho e a estrutura fluida dos Mollicutes, pela falta de uma parede celular, contribui para a sua capacidade de se esquivarem aos métodos de detecção e controle que adequados para outros tipos de microrganismos.

Os Mollicutes não possuem parede celular e podem penetrar filtros esterilizadores sob alta pressão, incluindo filtros de 0,1 mm. A quantidade extremamente baixa que pode atravessar os filtros de esterilização aumenta a probabilidade de que a contaminação seja indetectada durante os testes de pós-produção. (Windsor, Windsor e Noordergraaf).

Este artigo procura dar uma visão geral das características do Mycoplasma hyorhinis, muitas das quais são próximas às de outros micoplasmas, e sugere medidas que podem ser utilizadas para assegurar a sua detecção e controle adequados.

Mycoplasma hyorhinis pode estar presente em matérias-primas de origem natural, particularmente aditivos em pó para cultura celular, incluindo soro bovino e caldo de soja tripticase. O crescimento de Mycoplasma hyorhinis em meio para micoplasma sugere que ele apresenta alguns requisitos nutricionais mínimos. Foi reconhecida a relação entre o aumento da utilização da esterilização por filtro em processo (em oposição à esterilização por calor) e o aumento no número de eventos de contaminação por Acholeplasma.

Os eventos de contaminação por Mycoplasma e Acholeplasma podem alterar as propriedades das culturas celulares e dos subprodutos celulares comprometendo, até mesmo, os biofármacos.

A ocorrência significativa de micoplasmas, incluindo Mycoplasma hyorhinis, em culturas celulares, que são uma técnica do campo da biotecnologia, pode ter, estimada, taxas de 15% a 35% de todos os processos de cultura celular ².

O isolamento de Acholeplasma laidlawii tem sido menos associado à utilização de meios sem soro ^{3 4}. Por isso, sempre que possível, é preferível utilizar meios sem soro. Precauções adicionais incluem a utilização de água esterilizada por calor, ao invés de filtrada, para reconstituição dos pós adicionados aos meios de cultura. Laidlaw e Elford descobriram que as culturas se inviabilizavam quando expostas a 55°C durante 5 min além de notarem uma redução considerável nos números após 15 min a 45°C. Windsor, Windsor e Noordergraaf confirmaram estes resultados da inativação de Acholeplasma laidlawii dentro de 20 min a 50°C e 60°C mas não a 40°C.

De acordo com estes mesmos investigadores: "... não se sabe atualmente como A. laidlawii adentra a biocarga dos pós ou se pós similares (peptonas ou albúmen) são a única fonte possível deste contaminante em meios de cultura celular sem soro.” E, "A capacidade deste organismo de passar por filtros de esterilização e posteriormente alcançar níveis elevados em caldos de peptona ou em formulações de meios de cultura celular armazenados a temperaturas de refrigeração tem sérias implicações para a indústria biofarmacêutica."

Os testes realizados para a detecção desses contaminantes no ambiente de farmacêutico é um requisito geral das entidades regulatórias. As orientações para esta análise estão indicadas em: United States Pharmacopeia (USP) Capítulo <63> Testes de Micoplasma, na European Pharmacopoeia (EP) Capítulo 2.6.7 Micoplasmas, FDA 1993 Points to Consider (PTC), e no Code of Federal Regulations 21 CFR 610.30.

Os contaminantes de micoplasma como Mycoplasma hyorhinis podem facilmente passar desapercebidos, uma vez que permanecem invisíveis a olho nu e à microscopia luminosa mesmo quando em níveis altos. Os testes de rotina são necessários para assegurar que as culturas celulares não estejam contaminadas e inclusive que os lotes subsequentes não tenham sido contaminados por um lote anterior. Os métodos de detecção incluem: crescimento direto do caldo/ágar, coloração específica do DNA, testes PCR e ELISA, marcação do RNA e procedimentos enzimáticos.

Há várias tecnologias disponíveis no mercado para a detecção de micoplasmas no geral, cada uma com as suas vantagens e desvantagens. Entre as vantagens que se deve considerar estão a cobertura de detecção de Mollicutes e a especificidade para cada espécie detectada. Um índice baixo de resultados falsos positivos também é importante. Métodos desfavorecidos fornecerão falsos positivos, consumirão tempo e trabalho e não terão a especificidade desejada.

Mediante o sequenciamento do genoma completo do Mycoplasma hyorhinis⁵ e outros Mollicutes, o PCR permite a sua deteção rápida e específica. O novo painel BIOFIRE® MYCOPLASMA para detecção de micoplasma, inclui um primer para Mycoplasma hyorhinis, além de um painel completo para demais Mollicutes. O preparo e realização de amostras e testes são simples e automáticos. Os resultados ficam prontos em menos de uma hora.

Chandler, Volokhov e Chizhikov argumentam que M. hyorhinis, e talvez esta preocupação deva estender-se a todos os Mollicutes, ode ser mais susceptível de contaminar peptonas e deve ser especificamente impedido.

Em geral, vacinas e produtos recombinantes de bactérias ou leveduras não são testados para o micoplasma, principalmente porque estes organismos de produção crescem rapidamente em meios que não devem permitir a replicação do micoplasma, cujo crescimento é lento. No entanto, há uma ressalva baseada em artigos recentes de que as peptonas (por exemplo, produtos de triptona de soja esterilizados por filtração) utilizadas em meios microbiológicos e de cultura celular possam estar contaminadas com micoplasmas viáveis, especificamente M. hyorhinis ⁶. Esta observação faz com que seja importante avaliar cuidadosamente todas as matérias-primas devido à potencial contaminação por micoplasma ou ter em vigor procedimentos que atenuem o risco de matérias-primas contendo micoplasma viável, tais como o pré-tratamento de matérias-primas com radiação ultravioleta.

Esta observação faz com que seja importante (1) avaliar cuidadosamente todas as matérias-primas em razão da potencial contaminação por micoplasma ou (2) ter em vigor procedimentos que atenuem o risco de incidência de micoplasmas viáveis em matérias-primas contendo micoplasma, como o pré-tratamento de matérias-primas com radiação ultravioleta.

As orientações de controle (ou medidas de controle) da indústria fornecem recomendações sobre a melhor forma de controlar Mycoplasma hyorhinis com eficácia, por exemplo, em meios de cultura, soros e componentes do processo.

O foco está na aquisição seletiva com um programa de gestão de fornecedores documentado, Boas Práticas de Fabricação (BPFs), Análise de Perigos e Controle de Pontos Críticos (HACCP/APPCC), programas de pré-requisitos, e atividades consistentes de melhoria contínua.
Estes são meios que todas as fábricas podem utilizar para alcançar o objetivo de redução de Mycoplasma hyorhinis. Dá-se especial atenção às Práticas de Compra de Matérias-Primas, Expedição/Recepção de Insumos, Instalações Físicas, Funcionários e Visitantes das Fábricas, Procedimentos e Políticas das Fábricas (Saneamento e Limpeza, Controle de Pragas, Manuseio de Materiais, Controle de Pó e Fluxo de Ar, Controle de Umidade), Manutenção e Operação de Equipamentos, Embalagem, Armazenamento e Transporte, Procedimentos de Controle, Amostragem e Análise.

Mycoplasma hyorhinis é relevante para todos os setores biofarmacêuticos que empregam técnicas de cultura de células.

_Referências

_{¹ Considerations for risk and control of mycoplasma in bioprocessing, Angart et al., Current Opinionin Chemical Engineering, 2018,22:161–166.
² The scope of mycoplasma contamination within the biopharmaceutical industry, Armstrong, Mariano , Lundin., Biologicals. 2010 Mar;38(2):211-3. doi: 10.1016/j.biologicals.2010.03.002.
³ Low IE. Isolation of Acholeplasma laidlawii from commercial serum free tissue culture medium and studies on its survival and detection. Appl Microbiol 1974:1046–52.
⁴ Beardsley T. Contamination at flow labs. Nature 1983;304:674.
⁵ Complete Genome and Proteome of Acholeplasma laidlawii, Lazarev et al., Journal of 5 Bacteriology Aug 2011, 193 (18) 4943-4953; DOI: 10.1128/JB.05059-11.
⁶ PDA (2010) Technical Report No. 50: Alternative Methods for Mycoplasma Testing. Bethesda, MD.}