Santa Clara (CA), USA et Marcy l'Etoile, France - 11 janvier 1999. Dans le numéro de janvier 1999 de Journal of Clinical Microbiology, Alain Troesch (bioMérieux) et coll.1 démontrent pour la première fois qu’il est possible, grâce à une puce à ADN à haute densité (GeneChip®), de typer génétiquement (génotypage) toutes les espèces de mycobactéries d’intérêt clinique, incluant les espèces du complexe de M. tuberculosis, et les mycobactéries atypiques.

Identifier les espèces et déterminer leur profil de résistance
Le genre Mycobacterium regroupe environ 80 espèces et sous-espèces de bactéries. Parmi les espèces pathogènes, une dizaine sont responsables de 90 % des mycobactérioses rencontrées chez l’homme.

La tuberculose est la principale de ces pathologies. Elle est due aux espèces du complexe Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis et M. africanum). Les autres pathologies résultent d’infections opportunistes, particulièrement chez le sujet immunodéprimé, impliquant au total plus d’une dizaine de mycobactéries dites atypiques. Il s’agit de M. xenopi et M. kansasii responsables d’atteintes pulmonaires, ganglionnaires, ostéoarticulaires, cutanées et sous-cutanées, et d’espèces du complexe Mycobacterium avium-intracellulare, responsables d’infections généralisées chez les patients atteints du sida.

Dans les travaux qu’ils rapportent, Troesch et coll. sont parvenus, en utilisant une même puce à ADN, GeneChip®, à répondre simultanément à deux questions du diagnostic biologique des infections à mycobactéries : l’identification de l’espèce, et son profil de résistance à la rifampicine (l’antibiotique de référence de la trithérapie recommandée en première intention pour le traitement de la tuberculose). Dans le contexte de l’émergence de souches multirésistantes, les réponses à ces questions sont devenues cruciales pour la mise en œuvre immédiate d’un traitement adapté.
L’identification des espèces de mycobactéries repose sur le génotypage d’une région du génome bactérien présentant un fort polymorphisme, la région de l’ARN ribosomal 16S. Cette région, utilisée dans plusieurs tests de diagnostic moléculaire déjà commercialisés, est considérée comme " l’étalon or " de la spécificité d’espèces pour les mycobactéries, et son analyse permet d’en retrouver la signature.

Une approche similaire permet de définir le profil de résistance à la rifampicine des espèces du complexe M. tuberculosis. On sait en effet, que dans 90 % des cas, cette résistance est conférée par des mutations très localisées, situées dans la région du gène codant pour une ARN-polymérase bactérienne, le gène rpoB.

Troesch et coll. ont amplifié ces deux régions à partir d’isolats référencés de mycobactéries. Les produits d’amplification ont ensuite été marqués par fluorescence, puis hybridés à des sondes oligonucléotidiques spécifiques de l’une ou l’autre de ces régions présentées à la surface de la puce GeneChip®. Ces sondes, que les auteurs ont disposées sur la puce suivant une répartition ordonnée, sont identifiées d’après leur position.

Une fiabilité de 100 % pour chacune des réponses cherchées a été obtenue par cette approche méthodologique. Soixante-dix souches représentant 27 espèces de mycobactéries d’intérêt clinique, ont été testées. Les séquences de toutes ces espèces ont été correctement identifiées. Par ailleurs, parmi les souches de M. tuberculosis testées, les 15 souches résistantes à la rifampicine ont été reconnues comme telles. L’étude confirme également le pouvoir hautement résolutif du GeneChip®. Les résistances liées à des mutations ponctuelles (n’impliquant qu’un seul nucléotide) ont été détectées, aussi bien que celles impliquant un nombre plus élevé de nucléotides.

Une technologie à haute résolution
La technique du DNAchip a été développée par Fodor et coll.2&3 à Affymetrix, Inc. (NASDAQ : AFFX). Elle permet de produire une "biopuce", destinée à identifier des fragments d’ADN ou d’ARN marqués par fluorescence, grâce à leur hybridation avec de courtes séquences d’ADN, les sondes oligonucléotidiques. Dans le cas de la puce à ADN (GeneChip®), développée par Affymetrix, Inc. (NASDAQ : AFFX), les sondes oligonucléotidiques sont synthétisées in situ, par une technique alliant synthèse chimique sur support solide et photolithographie. Cette technique, issue de la microélectronique s’apparente à celle de la gravure. Elle repose sur la protection ou l’exposition à la lumière, par un jeu de pochoirs, de zones définies de la puce afin de rendre réactifs les groupements chimiques photosensibles désirés.

Le support, une surface de verre d’environ 1 cm2, constitue l’unité d’hybridation. Chaque unité d’hybridation peut contenir un nombre très élevé de sondes oligonucléotidiques uniques (jusqu'à 400 000), autorisant le traitement de plusieurs marqueurs en parallèle. Pour chaque marqueur, toutes les possibilités de séquence sont représentées sur la puce, une seule d’entre elles devant être rendue positive par l’échantillon à tester.

La positivité est détectée par l’intensité de la fluorescence, proportionnelle au degré d’hybridation entre la sonde et la séquence cible, et chaque sonde est identifiée d’après sa position sur la puce. Ainsi, parmi les séquences positionnées sur la puce conçue par Troesch et coll., 2 marqueurs sont représentés : un marqueur d’espèce (la région de l’ARN ribosomal 16S), et un marqueur de résistance à la rifampicine (la région du gène rpoB).

Plusieurs réponses en une seule puce
Le diagnostic d’une infection à mycobactéries repose sur deux approches : l’approche traditionnelle par examen microscopique du prélèvement, culture bactérienne puis identification des métabolites de la bactérie, et l’approche moléculaire, par reconnaissance de la signature génétique des microorganismes.
L’approche traditionnelle qui était jusqu’à récemment, la seule méthode disponible, comporte un inconvénient majeur : pour certaines espèces de mycobactéries, 3 à 4 semaines de délai sont nécessaires afin d’obtenir un résultat

Elle est de ce fait peu à peu supplantée par les méthodes moléculaires qui consistent à identifier les mycobactéries par génotypage. Plusieurs tests de ce type ont été récemment mis sur le marché. Produisant un résultat en 4 ou 5 heures, ces tests autorisent une réduction considérable du délai de mise en œuvre d’un traitement adapté et d’isolement éventuel du patient. Ils peuvent être réalisés directement à partir de l’échantillon biologique dans les cas où l’examen microscopique est positif (quantité suffisante de bactéries dans l’échantillon). Quand cet examen est négatif, les méthodes génotypiques nécessitent, au préalable, de réaliser une amplification par culture du matériel biologique ou une amplification enzymatique du matériel génétique.

La technique de GeneChip® ne se contente pas d’accélérer le diagnostic. Elle apporte deux avantages supplémentaires au regard des autres techniques moléculaires : son pouvoir résolutif et le traitement en parallèle de plusieurs questions diagnostiques.

Son pouvoir hautement résolutif permet de distinguer un bien plus grand nombre d’espèces de mycobactéries pathogènes chez l’homme, contrairement aux autres tests moléculaires, qui n’identifient que les plus fréquentes. Or l’émergence de mycobactéries atypiques responsables d’infections opportunistes rend nécessaire l’identification précise de chaque espèce. Elle permettra non seulement d’améliorer la prise en charge thérapeutique de ces infections, mais aussi d’améliorer la connaissance épidémiologique des mycobactéries atypiques, et en particulier leur répartition dans l’environnement.

Grâce aux possibilités offertes par la puce, il est envisageable de multiplier les réponses diagnostiques. En particulier, il est prévu d’intégrer sur la puce, des marqueurs de la résistance à d’autres antibiotiques, dont les bases moléculaires se précisent peu à peu.

Ainsi, la résistance à l’isoniazide a été récemment associée à des mutations dans les gènes de la catalase-peroxidase (KatG), dans les promoteurs des gènes inhA et ahpC, et dans le gène de la protéine kas A. De même, la résistance à la pyrazinamide semble associée à des mutations du gène pncA et, la résistance à l’éthambutol, au gène emb.

Les accords entre bioMérieux et Affymetrix portent leurs fruits
Les résultats de Troesch et coll. marquent une étape importante dans la réalisation des objectifs que se sont fixés Affymetrix, Inc. (NASDAQ : AFFX) et bioMérieux aux termes de leur accord de collaboration.

Cet accord signé le 21 octobre 1996 et élargi le 21 janvier 1998 prévoit le développement de tests de diagnostic fondés sur la technique du GeneChip® développée par Affymetrix, Inc. (NASDAQ : AFFX).

Il devrait aboutir à la commercialisation par bioMérieux d’un système de diagnostic complètement automatisé. Le principal domaine ciblé est la bactériologie infectieuse qui fait l’objet d’un accord exclusif. Deux autres domaines sont également concernés : le génotypage des souches du VIH résistantes aux thérapies antirétrovirales, et celui des agents microbiens de contamination dans le domaine alimentaire et cosmétique.

Le projet Anaïs® de bioMérieux, issu de cet accord, donnera à court terme, le jour à deux réactifs: une puce à ADN pour l’identification des mycobactéries (espèce et profil de résistance à la rifampicine), et une puce à ADN pour le génotypage du VIH. A long terme, ces réactifs devraient faire partie d’un système complètement automatisé de diagnostic des maladies infectieuses, intégrant toutes les étapes de la procédure, depuis la préparation de l’échantillon jusqu’au rendu des résultats. Le projet prévoit également l’extension du menu à d’autres marqueurs, de telle sorte que face à une situation pathologique donnée (infections respiratoires, infections génitales, etc.), un seul test GeneChip® suffise pour identifier l’agent pathogène en cause (bactérie, virus, levure ou parasite), à la fois en terme d’espèce et en terme de résistance aux traitements.

REFERENCES
1 Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, Desvarenne S, Gingeras TR, Kaplan PM, et al. Mycobacterium Species Identification and TB Rifampin Resistance Testing with High-Density DNA Probe Arrays. J Clin Microbiol 1999.
2 Lipshutz RJ, Morris D, Chee M, Hubbell E, Kozal MJ, Shah N, et al. Using oligonucleotide probe arrays to access genetic diversity. BioTechniques 1995; 19:442-447.
3 Fodor SPA, Read JL, Pirrung MC, Stryer L, Lu AT, Solas D. Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science 1991 ;251:767-773.

LA TUBERCULOSE

Une maladie ré-émergente
Première cause de mortalité par maladie infectieuse, la tuberculose touche, selon l’OMS, de manière symptomatique ou asymptomatique, 2 milliards de personnes au monde. Chaque année, elle est à l’origine de 3 millions de décès, dont 300 000 enfants de moins de 15 ans1.

La tuberculose concerne, dans 95 % des cas, les pays en développement, et essentiellement des sujets jeunes et adultes, âgés de 15 à 59 ans2. L’Asie est l’épicentre de l’épidémie. A eux seuls, l’Inde, la Chine, le Pakistan, l’Indonésie et les Philippines recensent 4,5 millions de cas sur les 8 millions qui sont enregistrés chaque année.

Dans les pays industrialisés, la tuberculose est en recrudescence après un déclin marqué au cours des dernières décennies. Deux facteurs se conjuguent : la dégradation des conditions socio-économiques dans certaines catégories de la population, et l’infection par le VIH. Quel que soit le pays, l’épidémiologie de la tuberculose est désormais étroitement liée à celle du sida. En effet, l’affaiblissement du système immunitaire augmente la contagiosité de la tuberculose, et favorise donc sa transmission. En 1994, on estimait que 5,6 millions de personnes étaient simultanément infectées par le VIH et par M. tuberculosis2. D’ici la fin du siècle, le VIH sera responsable de 750 000 nouveaux cas de tuberculose qui n’auraient pas existé sans lui.

Multirésistance : un problème émergent
La résistance aux antibiotiques est une préoccupation grandissante dans les pays industrialisés. Plusieurs épidémies de tuberculose dues à des souches multirésistantes sont survenues aux Etats-Unis depuis le début des années 1990, atteignant essentiellement des sujets infectés par le VIH, avec une mortalité d’environ 70 %2. Des observations similaires ont été rapportées en Europe, en particulier en France et en Italie. En France par exemple, sur les 8521 souches de bacilles tuberculeux recensées en 1992, 42 étaient multirésistantes.

La faiblesse des réseaux de surveillance limite les connaissances sur la résistance aux antibiotiques de M. tuberculosis dans les pays en développement. Les données disponibles suggèrent toutefois que les souches résistantes sont plus fréquentes que dans les pays industrialisés, en particulier en Asie. Plusieurs enquêtes menées dans cette région du monde font état d’un nombre important de cas de tuberculose multirésistante. Le rapport de l’OMS de 1998 montre par ailleurs que les pays les plus touchés par la tuberculose n’investissent pas suffisamment en moyens pour lutter efficacement. Il en résulte un mauvaise usage des traitements antituberculeux, favorable à l’émergence de souches résistantes.

Traitement
Le traitement de la tuberculose est bien codifié, et poursuit trois objectifs : la guérison du patient, la réduction de sa contagiosité, le contrôle de l’émergence des souches résistantes aux antibiotiques. L’OMS3 recommande deux phases de traitement. La première phase, d’une durée de 2 mois, associe 4 antibiotiques bactéricides à forte dose, afin de tuer rapidement la majorité des bacilles. La 2e phase, d’une durée de 4 à 6 mois, associe des antibiotiques à moindre dose. Elle vise à éliminer les bacilles résiduels, et à prévenir une rechute éventuelle. La rifampicine, l’isoniazide et dans une moindre mesure, la pyrazinamide et la streptomycine sont les antibiotiques les plus bactéricides contre le bacille de Koch. L’éthambutol et la thiocetazone possèdent une activité bactériostatique, et sont associés aux antibiotiques bactéricides en cas de suspicion de résistance.

Prévention : dépistage et vaccination
La prévention de la tuberculose repose d’une part sur le dépistage précoce et d’autre part, sur la vaccination par le BCG. Le dépistage précoce permet le traitement systématique, et limite donc la propagation de l’infection4.

La vaccination par le BCG fait partie du Programme élargi de vaccination. L’OMS la recommande de manière systématique à tous les nourrissons durant la première année de la vie, dans les pays à forte prévalence de la tuberculose4.

L’utilité de la vaccination BCG est en revanche controversée dans les pays à faible prévalence. Les incertitudes sur l’efficacité du vaccin BCG ont conduit certains pays, comme les Etats-Unis, à ne plus l’utiliser, et à axer la prévention sur le dépistage et le traitement systématique des sujets infectés, qu’ils soient ou non contagieux. D’autres pays la conservent, en raison de son efficacité attestée sur les formes extra-pulmonaires de la tuberculose. Dans ce cas, deux stratégies sont pratiquées : la vaccination des groupes à risque comme c’est le cas en Autriche, en Allemagne ou en Suisse, ou la vaccination systématique des enfants d’une tranche d’âge donnée, comme c’est le cas en France5. Cette dernière stratégie est complétée par des politiques de contrôle de la cicatrice laissée par le BCG, ou des réactions tuberculiniques post-vaccinales, dans la perspective d’une revaccination éventuelle.

REFERENCES
1 World Health Organization. State of the world's vaccines and immunization. Geneva: 1996.
2 Raviglione MC, Snider DE, Kochi A. Global epidemiology of tuberculosis: Morbidity and mortality of a worldwide epidemic. JAMA 1995; 273:220-226.
3 Maher D, Chaulet P, Spinaci S, Harries A. Treatment of tuberculosis: Guidelines for national programmes. 1997; Geneva: World Health Organization.
4 WHO statement on BCG revaccination for the prevention of tuberculosis. Bull WHO 1995; 73:805-806. Ref ID : 6854
5 Levy-Bruhl D, Guérin N. Les stratégies vaccinales par le BCG dans les pays européens. Santé Publique 1995; 3:283-291.